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CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古菌用來抵御病毒感染的重要免疫機(jī)制，近年來，它們也被開發(fā)為強(qiáng)大的基因編輯工具。I型CRISPR-Cas系統(tǒng)特別引人關(guān)注，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^識別特定的DNA序列并精確切割來保護(hù)宿主細(xì)胞。I-E型和I-F型CRISPR-Cas系統(tǒng)是這類系統(tǒng)的代表，其中的Cascade（CRISPR-associated complex for antiviral defense）復(fù)合體在找到目標(biāo)DNA后執(zhí)行切割功能。最近，研究人員通過從宏基因組中發(fā)現(xiàn)了帶有HNH結(jié)構(gòu)域的I-E型和I-F型變體，這些變體能夠精確切割目標(biāo)DNA，從而成為潛在的基因編輯工具。然而，這些復(fù)合體執(zhí)行DNA切割的具體機(jī)制仍然不為人知。

本研究旨在揭示I-EHNH和I-FHNH型CRISPR-Cas系統(tǒng)中HNH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的靶向DNA切割的具體機(jī)制。通過解析這些系統(tǒng)在不同狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，希望弄清楚這些系統(tǒng)如何識別、結(jié)合并切割目標(biāo)DNA，進(jìn)而理解其潛在的應(yīng)用價值。

為了探究這些CRISPR-Cas系統(tǒng)的工作機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了以下步驟：

1. 結(jié)構(gòu)解析：利用冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）技術(shù)，解析I-EHNH和I-FHNH型CRISPR-Cas系統(tǒng)的Cascade復(fù)合體在不同狀態(tài)下的高分辨率結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)為理解復(fù)合體如何識別和切割DNA提供了基礎(chǔ)。

2. 蛋白-DNA相互作用研究：通過結(jié)構(gòu)比對和突變分析，研究了HNH結(jié)構(gòu)域與目標(biāo)單鏈DNA（ssDNA）的結(jié)合模式，以及R-loop（RNA-DNA雜交結(jié)構(gòu)）的形成如何驅(qū)動復(fù)合體的構(gòu)象變化。

3. 動力學(xué)分析：通過對復(fù)合體的構(gòu)象變化進(jìn)行建模，模擬了HNH結(jié)構(gòu)域在DNA切割過程中如何旋轉(zhuǎn)和定位，進(jìn)一步揭示了其切割機(jī)制。

研究團(tuán)隊(duì)成功解析了I-EHNH和I-FHNH型CRISPR-Cas系統(tǒng)的Cascade復(fù)合體在不同狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，并揭示了關(guān)鍵機(jī)制：

在這種系統(tǒng)中，Cas8fHNH蛋白松散地附著在Cascade復(fù)合體的頭部，鄰近目標(biāo)ssDNA的5'端。當(dāng)R-loop完全形成后，Cascade復(fù)合體的頭部向外移動，促使Cas8fHNH蛋白脫離并旋轉(zhuǎn)約150°，使其能夠適應(yīng)并切割目標(biāo)ssDNA。在這種系統(tǒng)中，Cas5eHNH結(jié)構(gòu)域位于目標(biāo)ssDNA的5'端附近。當(dāng)crRNA與目標(biāo)DNA完全配對時，Cascade復(fù)合體的頭部抬起，擴(kuò)大了底物通道，使目標(biāo)ssDNA能夠進(jìn)入并被切割。研究發(fā)現(xiàn)，crRNA引導(dǎo)的目標(biāo)DNA定位以及目標(biāo)DNA誘導(dǎo)的HNH結(jié)構(gòu)域解鎖是這兩種系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)特異性DNA切割的兩個關(guān)鍵因素。

圖源：Cell（2024），doi：10.2147/BTT.S326422

本研究通過解析I-EHNH和I-FHNH型CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，揭示了HNH介導(dǎo)的靶向DNA切割機(jī)制。這些系統(tǒng)中，Cascade復(fù)合體的動態(tài)構(gòu)象變化和HNH結(jié)構(gòu)域的精準(zhǔn)定位對于實(shí)現(xiàn)特異性切割至關(guān)重要。這一發(fā)現(xiàn)不僅拓展了我們對CRISPR-Cas系統(tǒng)多樣性和功能的理解，還為開發(fā)新的基因編輯工具提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

未來的研究可以進(jìn)一步探索這些變體在不同生物系統(tǒng)中的適應(yīng)性，并利用這些結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)出具有更高特異性和效率的基因編輯工具。這些研究將有助于推動CRISPR技術(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和生物工程等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

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